從HTLV-1感染到ATL的發展，細胞是如何分階段變化的?

國家癌癥中心研究所9月6日宣布，該所利用最新技術--單細胞多組學分析，闡明了人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染引起的成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)的多步驟致癌的分子機制。 這項研究是由該研究所分子腫瘤學系的高級研究員古谷淳史、志愿實習生齋藤由紀、慶應義塾大學醫學院內科(血液學)系的教授片岡圭介(他還擔任國家癌癥中心分子腫瘤學部主任)和宮崎大學醫學院血液學、糖尿病和內分泌學系的教授下田和也領導的研究小組進行的。 和京都大學醫學院研究生院腫瘤生物學系的小川誠司教授。 該研究的結果已發表在《血癌發現》上。

成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)是一種造血腫瘤(血癌)，是由HTLV-1感染引起的CD4陽性T細胞腫瘤，在日本發病率很高。 主要的感染途徑是在嬰兒期通過母乳進行母嬰傳播。 近年來，由于徹底的健康指導，無癥狀攜帶者和ATL新病例的數量一直在減少。 近年來，由于健康指導和其他措施，無癥狀攜帶者的數量和ATL的新病例一直在減少。 然而，ATL仍然每年影響約700人，而且預后很差，除了造血干細胞移植外沒有治愈性治療。

HTLV-1感染后，病毒衍生的蛋白Tax會引起CD4陽性T細胞的永生化，但只有不到5%的HTLV-1攜帶者最終會發展為ATL，主要是通過免疫反應。 發展ATL需要很長的時間。 據推測，在這段漫長的時間里，不僅是HTLV-1感染的細胞，而且還有免疫細胞，主要是淋巴細胞，它們之前一直在監測和抑制HTLV-1感染細胞的增殖，發生了變化，導致存在異質性的細胞特征。

然而，迄今為止的研究技術只允許在不同類型的細胞混合物上進行全面的基因表達分析，并且只能確定數百至數萬個細胞的異質群體的平均狀態。 然而，最近的技術創新使得在單細胞水平上進行全面的基因表達分析成為可能，通過從含有多種細胞類型的臨床樣本中分離出單個細胞，從而評估細胞群的異質性和多樣性。 研究小組利用單細胞多組學分析，即這種單細胞基因表達分析技術的進一步發展，來研究HTLV-1和ATL中感染細胞、腫瘤細胞和免疫細胞的異質性和多樣性。

作為一種研究方法的 "單細胞多分子分析

單細胞多組學分析是一種最先進的研究方法，不僅能提供單個細胞的綜合基因表達數據，還能提供100多個細胞表面標志物和T細胞/B細胞受體復合物的信息。

在常規的臨床實踐中，使用流式細胞儀分析細胞表面標志物，是對細胞類型進行分類的一個非常有用的工具，但直到現在，由于技術問題，每次只能對單個細胞的幾個到20個細胞表面標志物進行檢查。 在這項研究中，我們使用了針對每種標記物的抗體的寡核苷酸條碼，然后可以在下一代測序儀上進行分析，這使得原則上可以同時測量超過幾千個細胞表面標記物。 在血液學和免疫學中，細胞表面標志物已被用來對細胞類型進行分類以進行功能分析。 新方法是一個創新的實驗系統，將積累的表面標志物信息與全面的單細胞基因表達分析結果直接聯系起來。

它也非常有用，因為它允許我們結合T細胞和B細胞受體的重復。 要區分正常淋巴細胞、非腫瘤感染的淋巴細胞和腫瘤性ATL細胞是非常困難的，這一直是研究ATL發病機制的一個障礙。 現在，通過同時獲得T細胞受體-肝臟信息，可以明確區分單克隆增殖的腫瘤細胞。

通過將這種單細胞分析與個別臨床標本的基因畸變、患者的臨床數據以及一系列功能實驗相結合，研究人員能夠提供HTLV-1感染和ATL發病機制的全面情況，提高對發病機制的理解，并確定新的治療目標。

在單細胞水平上準確識別HTLV-1感染的細胞，實現了對細胞群的表達分析

首先，用4個健康捐贈者樣本、11個無癥狀的HTLV-1感染攜帶者和34個ATL外周血單核細胞來分選有活力的細胞，然后用寡核苷酸標記102抗體，制備RNA樣本進行單細胞分析，并使用新一代的 測序。 我們從總共49個樣本中獲得了233,093個細胞的綜合基因表達、細胞表面標志物和T細胞/B細胞受體復合物的信息。

在綜合基因表達數據的基礎上，用統一的矩陣逼近和投影(UMAP)方法將聚類的結果繪制成二維圖。 此外，有代表性的細胞表面標志物被用來劃分每個細胞群屬于哪種細胞類型，根據上述T細胞受體重復分析的結果，CD4陽性T細胞被分為腫瘤細胞和非腫瘤細胞。

然后提取非腫瘤CD4陽性T細胞，重新聚類并重新繪制在二維表面上，并與HTLV-1衍生的mRNA--HBZ的表達水平相疊加。 我們能夠清楚地區分非感染性的幼稚和效應記憶CD4陽性T細胞和非腫瘤性的HTLV-1感染的CD4陽性細胞。 這項工作可以對非感染的正常CD4陽性T細胞、非腫瘤HTLV-1感染的CD4陽性細胞和腫瘤ATL細胞之間的基因表達進行比較分析。

分析顯示，與未感染的幼稚和效應記憶CD4陽性T細胞相比，在非腫瘤HTLV-1感染的細胞中，一組對抗原呈現很重要的分子的表達明顯上調。 對上調最多的mRNA分子LGALS1的功能分析顯示，LGALS1的高表達使感染的細胞能夠避免細胞毒性T細胞攻擊誘發的凋亡。

細胞表面標志物表達分析確定CD99是一種分子，其表達隨著從非HTLV-1感染的CD4陽性T細胞發展到HTLV-1感染的CD4陽性T細胞，然后發展到ATL而增加。 這可能是一個新的治療目標。

HTLV-1感染細胞的克隆擴展程度可能是ATL進展的一個生物標志物

研究人員還關注了非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽性T細胞，并疊加了T細胞受體曲目。 他們發現，一些非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽性T細胞已經在克隆生長。 重要的是，在無癥狀攜帶者樣本中，克隆增殖的程度與外周血單核細胞中HTLV-1感染的CD4陽性T細胞的比例成正比，表明這是一個潛在的ATL進展的生物標志物。

對非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽性細胞的基因表達分析，分為非克隆性感染細胞和克隆性增殖細胞，顯示在感染期間上調的MHC II類分子在克隆性增殖感染的CD4陽性T細胞中下調，這表明逃避免疫系統有助于克隆性增殖。

HTLV-1感染和ATL進展過程中免疫微環境的變化

為了評估HTLV-1感染和ATL發展過程中的免疫微環境，我們比較了非腫瘤細胞中各血細胞部分的比例。 我們發現在HTLV-1和ATL中都觀察到CD8陽性T細胞的減少，而B細胞的減少和骨髓細胞的增加則是ATL狀態的特有現象。

還分析了腫瘤細胞的基因異常對免疫微環境的影響：20-30%的ATL病例有CD274的mRNA結構異常，CD274編碼免疫檢查點分子PD-L1，這些異常增加了ATL細胞中PD-L1的表達，有助于逃避免疫機制的影響。 這種基因異常已被證明可上調ATL細胞的PD-L1表達，有助于它們逃避免疫系統。 分析發現，腫瘤細胞的這種基因異常也會導致PD-L1在非腫瘤細胞如B細胞和骨髓細胞中的表達增加。

研究人員分析了Pd-l1在基因工程小鼠中的表達，這些小鼠專門模仿了CD4陽性T細胞中的Pd-l1 mRNA結構異常。 我們發現Pd-l1的表達不僅在CD4陽性T細胞中上調，而且在骨髓細胞中也上調，表明Pd-l1蛋白確實在體內轉移到其他細胞。

轉移到非腫瘤細胞的PD-L1也可能影響免疫微環境的變化

為了了解轉移到非腫瘤細胞的PD-L1是否參與了ATL的發病機制，該研究小組進行了共培養實驗。 首先，他們將永生化的HEK293T細胞與正常外周血單核細胞共同培養，并發現PD-L1確實被轉移到了細胞中。 此外，當PD-L1轉染的正常外周血單核細胞與活化的CD8陽性T細胞共同培養時，發現它們能抑制CD8陽性T細胞的增殖。

這項單細胞多組學分析還顯示，在PD-L1失調的患者中，CD8陽性T細胞的比例減少，這表明不僅腫瘤細胞上PD-L1的高表達，而且轉移到非腫瘤細胞上的PD-L1也可能影響免疫微環境的變化。

單細胞多組學分析有助于闡明以前在技術上不可能實現的致癌機制

這項研究是迄今為止對單一疾病進行的最大規模的單細胞多組學分析，全面展示了由HTLV-1感染引起的ATL的致癌分子機制，包括受感染的細胞、腫瘤細胞和免疫微環境。

正如這項研究所顯示的，單細胞多組學分析在揭示致癌機制方面極為有用，而這些機制在技術上是不可能用常規分析方法找到的。 該研究小組說："我們將繼續在單細胞多組學分析方面進行創新，并將該技術應用于臨床實踐，目的是進一步闡明全部致癌機制，并確定可能對疾病更有針對性、副作用更小的治療目標。